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技术文章 | Anti-HiBiT抗体解锁低丰度内源蛋白检测新方案
使用Anti-HiBiT单克隆抗体对内源性HiBiT标记蛋白进行免疫沉淀
HiBiT标签（11个氨基酸组成的肽段标签）利用NanoBiT®技术可实现灵敏的蛋白质定量，但与之互补的LgBiT亚基无法支持免疫沉淀或免疫荧光等传统抗体应用。为解决此局限，Promega开发的Anti-HiBiT抗体将HiBiT的应用扩展至免疫沉淀、免疫印迹、免疫荧光和流式细胞分选（FACS）中。该抗体与 HiBiT 的结合亲和力比LgBiT高2个数量级，并提供比常用表位标签抗体更高的灵敏度或特异性。
Anti-HiBiT抗体优势
Anti-HiBiT单抗与其他表位标签抗体相比的优势:
● 免疫荧光：对内源性表达的 HiBiT 标记蛋白可进行荧光显微成像，研究亚细胞定位。
● FACS分析：可用于分离表面表达 HiBiT 的活细胞，或在固定的渗透细胞中定量HiBiT 标记的蛋白。
● Western Blot：以最小的交叉反应检测低至皮克的 HiBiT标记蛋白。
● 免疫沉淀：从样品中快速沉淀高比例的 HiBiT标记蛋白。
Anti-HiBiT抗体应用
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Anti-HiBiT单抗能从样品中沉淀出高比例的HiBiT标记蛋白，即使靶标在裂解液中处于低水平。
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从CRISPR修饰的细胞裂解液中捕获内源性表达的靶标。
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对HiBiT标记蛋白的定量回收。
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将Anti-HiBiT抗体与NanoBiT®生物发光检测方法结合使用，可以对其他表位标签无法分析的样品进行分析。
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使用HiBiT Lytic Assay来确定每个细胞中HiBiT标记蛋白的数量以及靶标从裂解液中清除的百分比。
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使用Anti-HiBiT Western Blot来定量免疫沉淀洗脱液中的靶标。
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Anti-HiBiT抗体在靶向蛋白降解领域中应用广泛。
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对PROTAC三元复合物和分子胶互作蛋白进行免疫沉淀。
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富集靶标以监测PROTAC处理后的泛素化情况。
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使用Anti-HiBiT Western Blot来监测HiBiT标记蛋白的降解。
图中以红色标出了HiBiT在免疫沉淀工作流程中提供独特优势的检查点。
应用示例
HiBiT标记蛋白的免疫沉淀
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比其他单拷贝表位标签的免疫沉淀效率更高
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使用CRISPR/Cas9对HSP90B1蛋白进行串联标记：HiBiT+HA、Myc、1或3个拷贝的FLAG标签。
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从CRISPR池中产生裂解物，并将其分装，用于制备IP样品。
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分别使用Anti-HiBiT、Anti-Myc、Anti-HA或Anti-FLAG抗体（这些抗体均与磁性的Protein G树脂配合使用）对标记的HSP90B1蛋白进行免疫沉淀。
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HiBiT标签的免疫沉淀效果与3xFlag（三拷贝FLAG）相当，且优于单拷贝标签。
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对CRISPR修饰细胞中的HiBiT标记蛋白进行免疫沉淀
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在CRISPR修饰细胞中对内源性水平表达的HiBiT标记蛋白进行免疫沉淀。
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为了监测上清液中的蛋白清除情况和洗脱液中的蛋白回收情况，使用 Nano-Glo® HiBiT Blotting System 对原始裂解液样品、上清液和洗脱液的等量样本进行了分析。
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Anti-HiBiT单克隆抗体能够对在内源性水平和化学计量比表达的蛋白质进行免疫沉淀，从而避免了过表达所引入的假象。
抗体检测与生物发光法结合
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用于溶液中HiBiT定量的Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System
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这种灵敏的“加样-读数”生物发光检测，用于确定每个细胞中HiBiT标记蛋白的数量，从而可以在进行目标蛋白免疫沉淀之前，确定产生稳健目标信号所需的细胞裂解液体积。
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通过对起始裂解液和IP上清液进行HiBiT裂解分析，可以轻松确定被Anti-HiBiT单克隆抗体从裂解液中清除的HiBiT标记蛋白的百分比。生物发光信号（RLU）允许使用既定的标准曲线对HiBiT标记蛋白的摩尔数进行定量。
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下方所示，裂解液来源于在内源性水平表达LDHB-HiBiT的CRISPR修饰HeLa细胞。对裂解液进行10倍系列稀释，以模拟HiBiT标记靶标从高到低的表达水平。在整个稀释系列中，LDHB-HiBiT都从裂解液中被有效清除。
Anti-HiBiT Western Blot
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使用Anti-HiBiT蛋白质免疫印迹法进行HiBiT定量
通过Anti-HiBiT蛋白质免疫印迹法分析了等量的起始裂解液和IP洗脱液。每次IP使用0.5 ml起始裂解液，而洗脱液以0.1 ml的体积收集。每个印迹泳道都进行了图像调整以便于条带可视化。
输入量和输出量成正比，这证明使用Anti-HiBiT单克隆抗体进行的免疫沉淀能够实现对HiBiT标记蛋白的定量回收。
免疫沉淀-质谱分析联用
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基于质谱法检测免疫沉淀洗脱液中的HiBiT标记蛋白
对LDHB-HiBiT的免疫沉淀洗脱液进行了LC-MS/MS分析。捕获过程显示出高度的特异性，具体表现为靶蛋白的归一化总谱图数很高，而对照样品中检测信号极低。已知的互作蛋白LDHA也按预期得到了富集。LDHB-HiBiT和LDHA的信号与起始裂解液中的靶标量相关，而背景蛋白的谱图计数在所有洗脱液样本中保持恒定。
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通过质谱法对免疫沉淀洗脱液中的靶蛋白进行序列覆盖度分析
图中显示了LDHB-HiBiT靶标以及已知互作蛋白LDHA的肽段序列覆盖度。两种蛋白的覆盖度都很高，特别是当注入约50 fmol的标记蛋白时（该蛋白量通过Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System定量）。此处仅包含0.1% TFA的洗脱液。
靶蛋白降解研究
使用新品Anti-HiBiT Magne®磁珠（Anti-HiBiT 单抗与磁性纤维素颗粒共价偶联形成）捕获含HiBiT的蛋白质复合物。
PROTAC浓度越高，导致更多三元复合物形成。
总结
本文中，我们展示了在免疫沉淀工作流程中，将传统的基于抗体方法和定量的NanoBiT®生物发光分析相结合的应用，突显了HiBiT在表位标签中独特的灵活性。使用Anti-HiBiT抗体，可以实现内源性表达的HiBiT标记蛋白的定量捕获和洗脱。在免疫沉淀工作流程的关键检查点进行生物发光检测，可确保样品为下游分析提供所需信号。
资料下载
HiBiT蛋白标签技术
抗HiBiT单克隆抗体介绍
订购信息
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产品 |
规格 |
目录号 |
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1 ml 5 ml |
N7300 N7301 |
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0.1 ml |
N7400 |
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Anti-HiBiT Monoclonal Antibody
Anti-HiBiT Monoclonal Antibody-FarRad647 Anti-HiBiT Monoclonal Antibody-Green488 |
100 ug 5 x 100 ug 50ug 50ug |
N7200 N7210 N7221 N7231 |
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100 ml |
N2410 |
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10ml 100 ml 10x100 ml |
N3030 N3040 N3050 |
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400-810-8133
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